免疫球蛋白IgG的提取分离纯化

免疫球蛋白(Immunoglobulin Ig)【包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD】的含量代表着机体体液免疫的水平,并进一步代表着B细胞的功能,因此测定血清Ig含量可以推知机体的体液免疫功能和诊断某些疾病引起的Ig的过高和过低。

以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物,包括血清的全部成分。但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性,不应含有非抗体的血清蛋白。因此,为了浓缩和提高抗体的效价,或为制备免疫球蛋白特异性抗体时,通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。

γ球蛋白(IgG)是血清免疫球蛋白的主要成分,约占全部免疫球蛋白的75%,因此,抗体的分离纯化主要是分离纯化IgG。纯化的方法很多,有单一法,但大多数采用二步法以上相结合的方法,以硫酸铵沉淀后过DEAE纤维素柱,比较简便可获较纯的抗体。硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来(称为盐析)。不同浓度的硫酸铵盐析蛋白成分不同,利用这一原理提取所需的免疫球蛋白成分。盐析只能粗提,为了获得纯化的免疫球蛋白成分,必须进一步采用层析的方法进行分离。 如果纯化IgG小量几十mL,采用protein A或protein G即可,疏水柱等也可以纯化;对于上百mL的大量体积,可以采用streamline protein A。

一、材料与试剂配制

1.动物血清
2.饱和硫酸铵溶液:硫酸铵800g~850g,H2O 1000mL
加热至绝大部分溶质溶解为止,趁热过滤,置室温过夜,然后以28%NH4OH调pH至7.0(不调pH值也可以)。注:硫酸铵以质量优者为佳,因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属,可在溶液中通入H2S,静置过夜后滤过,加热蒸发H2S即可。
3.0.01 mol/L pH7.4 PB液:
A液:0.10 mol/L NaH2PO4液
NaH2PO4•2H2O 15.60g 加H2O至1000mL
B液:0.10Mol/LNa2HPO4液
Na2HPO4•12H2O 35.80g 加H2O至1000mL
取A液19mL,B液81mL加水至1000mL即可。
4.1%BaCl2溶液
5.纳氏液
HgI 115.00g
KI 80.00g加H2O至500.00mL
溶化后过滤,然后再加20% NaOH 500mL,混合即可。
6.0.50 mol/L 的HCl液和 0.50 mol/L的NaOH液。
7.洗脱液:0.03mol/L的NaCl液。
8.透析袋(或玻璃纸)。

二、操作方法
1.取20mL血清,加生理盐水20mL,再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液10mL,使成20%(NH4)2SO4溶液,边加边搅拌,充分混合后,静置30min。
2.3000r/min离心20min,弃去沉淀,以除去纤维蛋白。
3.在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液30mL,使成50% (NH4)2SO4溶液,充分混合,静置30min。
4.3000r/min离心20min,弃上清。
5.于沉淀中加20mL生理盐水,使之溶解,再加(NH4)2SO4饱和溶液10mL,使成33%(NH4)2SO4溶液,充分混合后,静置30min。
6.3000r/min离心20min,弃上清,以除去白蛋白。重复步骤5,2~3次。
7.用10mL生理盐水溶解沉淀,装入透析袋。
8.透析除盐,在常水中透析过夜,再在生理盐水中于4℃透析24h,中间换液数次。
以1%BaCl2检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4+(取3~4mL透析液,加试剂1~2滴,出现砖红色即认为有NH4+存在),直至无SO42-或NH4+出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。
9.离心去沉淀(去除杂蛋白),上清液即为粗提IgG(即γ球蛋白,如以36%的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白,Euglobin,含γ球蛋白)。
10.过DEAE-纤维素层析柱。(装柱过程见层析技术)。以0.01Mol/LpH7.4PBS(0.03Mol/LNaCl)洗脱,收集洗脱液。也可采用SephadexG150或G200柱。
11.蛋白质及其定量鉴定。
12.IgG的纯度鉴定可采用下列方法之一鉴定。
(1)区带电泳:玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后,只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时,同时可用全血清样品,不同浓度(NH4)2SO4盐析样品进行电泳,以资比较。
(2)琼脂双相双扩散鉴定:预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散,如IgG提纯的话,则在两样品孔之间出现一条沉淀线。
(3)免疫电泳鉴定:孔内加待测样品,电泳后,在槽内加抗IgG血清,琼脂扩散24h,观察结果。如果提取的IgG纯的话,则只出现一条弧形的沉淀线,且沉淀线位于γ—球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳,以资比较。
(4)圆盘电泳鉴定:用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带,而纯化的IgG则只有一条区带。
13.IgG的浓缩与保存
(1)IgG的浓缩:
(2)IgG的保存:一般浓缩至1%以上的浓度,再分装成小瓶冻干保存,或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存,注意防止反复冻融。

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